[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Kurs „Genetyka molekularna”
w ramach specjalizacji z laboratoryjnej genetyki medycznej –
MODUŁ III
nr kursu: 8-021/03/01-002-2011
Łódź, 26-30 września 2011
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Metody oparte na mikromacierzach pozwalają na:
•
wykrywanie niezrównoważeń w
regionach
subtelomerowych
lepiej niż technika FISH
•
wykrywanie rearanżacji genomu
Wykorzystanie mikromacierzy
w praktyce klinicznej
Metoda opisana po raz pierwszy w 1997 roku jako
u pacjentów z
pozornie
zrównoważonymi translokacjami
•
wykrycie mozaikowości będącej przyczyną nieprawidłowego
fenotypu
•
prenatalne wykrycie aberracji submikroskopowych, w tym także
powstałych
de novo
•
określenie roli submikroskopowych duplikacji w NI związanej
z chromosomem X oraz innych zespołach związanych z NI
•
identyfikację
porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy
(array-CGH; a-CGH)
Wanda Hawuła
Zakład Genetyki
Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
ul. Rzgowska 281/289; 93-338 Łódź
tel. 042 271-11-83
nowych
chorób
spowodowanych
przez
mikroduplikacje
i
mikrodelecje,
ciągle
opisywanych
i katalogowanych w bazach danych np. DECIPHER
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Techniki z użyciem mikromacierzy umożliwiają
analizę całego genomu z bardzo dużą
rozdzielczością
Rozdzielczość badań za pomocą a-CGH zależy od
Mikromacierze DNA
CGH – identyfikacja zmiany liczby kopii sekwencji DNA
•
wielkości
i
liczby
sekwencji
docelowych
umieszczonych na macierzy
SNP - identyfikacja zmiany liczby kopii sekwencji DNA
wykrywanie zmian wielkości od 10-tek do
100 kpz, to jest 100 razy mniejszych niż zmiany
identyfikowane przy pomocy metod cytogenetyki
konwencjonalnej
identyfikacja disomii jednorodzicielskiej
•
od ich pozycji (rozmieszczenia, gęstości) w genomie
identyfikacja utraty heterozygotyczności
•
informacja generowana przez każdą sondę zależy
zarówno od jej wielkości i składu
identyfikacja mutacji punktowych
medycyna genomowa
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Pojęcie chorób genomowych opiera się na dwóch
założeniach:
wiele chorób powstaje w wyniku rearanżacji
genomowych często niewidocznych
w mikroskopie świetlnym
Rearanżacje DNA
w większym stopniu niż
zmiany
pojedynczych nukleotydów
mogą być odpowiedzialne
•
choroby genomowe wywoływane są przez rearanżacje
genomowe a nie przez zmiany sekwencji DNA
za ewolucję gatunku człowieka, zmienność osobniczą,
a może również za podatność i/lub powstawanie chorób
•
architektura genomu powoduje jego niestabilność,
to budowa genomu predysponuje go do rearanżacji,
wynikiem których są cechy chorobowe
choroby genomowe (genomic disorders
)
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Nazwa „
wariant
” jest właściwsza niż „
polimorfizm
”
Istnieje wiele regionów genomu różniących się nie tyle
w odniesieniu do sekwencji, ile do ilości kopii którą
poszczególny osobnik posiada
w konkretnym regionie genomu
Copy Number Variants (CNV)
ponieważ częstość występowania większości CNVs nie
mikroduplikacje
jest jeszcze dobrze udokumentowana, a pojęcie
large-scale variations
polimorfizmu zakłada jego występowanie z częstością
copy number abnormalities
równą lub wi
Ę
kszą 1% w danej populacji
copy number changes
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
•
kopie CNV zidentyfikowano aż w 1.447 regionach genomu
o łącznej długości 360 mpz, co stanowi 12% naszego genomu
CNV definiuje się jako
…zmianę liczby kopii w danym regionie genomu
•
średnia wielkość kopii CNV mieści się w przedziale 81-341 kpz
fragment genomu, o wielkości powyżej 1 tysiąca par
zasad, o zmienionej liczbie kopii w porównaniu z
genomem referencyjnym
•
w 58% zidentyfikowanych kopii CNV stwierdzono obecność
genów, w 99% zakonserwowane niekodujące sekwencje DNA,
a w 24% kopie LCR
z udziałem fragmentu DNA większego niż 1 kb
•
kopie CNV stanowią łącznie więcej DNA niż wszystkie znane
dotychczas SNP
lub jako…
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Przypuszczalne przyczyny
„harmless del/dup”:
•
pathogenic CNV
– CNV powodujący poważne skutki
kliniczne
• del/dup regionów o niskiej zawartości genów
• del/dup pseudogenów
• efekt pozycji
• inaktywacja zduplikowanych fragmentów
• del/dup genów działających przy szerokim zakresie
dawki np. „haplosufficient genes”
• geny, które uległy delecji mają kopie w innych
regionach genomu (kompensacja)
• przed delecją materiał uległ imprintingowi
• płynna granica między prawidłowym a nieprawidło-
wym fenotypem
Definicja CNV nie mówi nic na temat skutków
klinicznych danego niezrównoważenia i może być
myląca dla genetyków klinicznych i cytogenetyków,
rozumiejących termin „wariant” jako zmianę
nieistotną klinicznie
•
benign CNV
– CNV nie powodujący lub powodujący
łagodne skutki kliniczne
•
CNV of unknown clinical significance
– CNV, którego
znaczenie
kliniczne
nie
jest
znane
przy
obecnym
nie sugeruje również dawki
stanie wiedzy
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Przyczyny patogenności CNV c.d.
CNV wywołujące poważne skutki fenotypowe
•
leżą w obrębie w obrębie regionów kodujących
analizowanych genów
•
stwierdzona del/dup jest znana jako przyczyną
nieprawidłowego fenotypu
•
jeśli CNV zawiera gen, który powoduje określony fenotyp
jeśli jest inaktywowany (jeśli CNV jest delecją) lub jest
w zwiększonej dawce (jeśli CNV jest duplikacją)
•
wielkość zmiany – CNVs, które są większe (≥ 1Mpz) są
uważane za bardziej patogenne niż mniejsze (≤0,1Mpz)
•
delecje są bardziej patogenne niż duplikacje
•
zmiany powstałe
de novo
(!!! Nonpaternity)
•
w obrębie kopii CNV (lub jej sąsiedztwie) znajdują się
geny, których ekspresja zależna jest od dawki,
rozumianej jako liczba sekwencji tego genu
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
•
objęcie pacjenta opieka odpowiednich specjalistów
(zapobieżenie lub wczesne wykrycie objawów związanych
z chorobą np. otyłości w zespole Williamsa)
•
ukierunkowanie opieki medycznej (screening w kierunku
wady serca, jeśli choroba jest z nią związana)
•
jest niezbędna do udzielenia porady genetycznej
•
wpływa na decyzje prokreacyjne rodziców chorego dziecka
•
poznanie przyczyny choroby dziecka zmniejsza niepewność
i łagodzi poczucie winy
•
minimalizuje ilość procedur diagnostycznych, często
inwazyjnych, którym poddawany jest pacjent
•
może ujawnić istnienie zrównoważonej rearanżacji
chromosomowej u rodzica nosiciela
Mikromacierze genomowe
Do zapamiętania:
zmiana strukturalna wpływa nie tylko na
gen poprzez zmianę liczby jego kopii lub
powodując przerwanie jego ciągłości,
powinniśmy rozważyć jej wpływ także na
geny sąsiadujące
Znaczny wzrost możliwości diagnostycznych
chorób genomowych w porównaniu
z dotychczasowymi technikami
Precyzyjna diagnoza
Sposób opieki nad pacjentem
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Badania aberracji chromosomowych obecnych
w pojedynczych blastomerach za pomocą techniki FISH
są obarczone pewnym błędem
Do badania używa się 3-6 sond komplementarnych do
chromosomów najczęściej zaangażowanych
w aberracje wykrywane w tkankach z poronień
samoistnych
Brak informacji dotyczących aberracji innych
chromosomów
Brak możliwości wykrycia segmentalnych aberracji
(sondy są komplementarne do centromerów i zwykle
wykrycie trzeciego sygnału interpretuje się jako
trisomię danego chromosomu, choć może być to inny
rodzaj aberracji)
Mikromacierze w diagnostyce preimplantacyjnej
Mikromacierze w diagnostyce preimplantacyjnej c.d.
Około 5-10% par doświadczających samoistnych
poronień to pary, w których jedno z partnerów jest
nosicielem zrównoważonej rearanżacji
chromosomowej, w tym także złożonej
PGD oferowana takim parom:
•
redukuje ryzyko samoistnych poronień
•
zmniejsza szanse posiadania potomstwa będącego
nosicielem zmiany
•
zwiększa szansę utrzymania ciąży poprzez
eliminację zarodków z niezrównoważoną aberracją
chromosomową (technika FISH)
Pary te ponoszą znacznie większe ryzyko urodzenia
dziecka z niezrównoważonym kariotypem
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Kurs „Genetyka molekularna”
Łódź, 26-30.09.2011 r.
Wskazania do badania prenatalnego za pomocą
mikromacierzy
Metoda aCGH na poziomie jednej komórki
Tylko 25-30% poczęć kończy się urodzeniem żywego
dziecka
Rozwój pozostałych 70-75% zarodków zostaje
zatrzymany na różnych etapach rozwoju ciąży,
w dużym stopniu z powodu aberracji
chromosomowych
Niektóre z nich obserwujemy podczas diagnostyki
prenatalnej lub badania płodów poronionych, inne
umykają uwadze ponieważ występują tylko
w niewielkim procencie komórek płodu lub są dla
płodu letalne
Badanie liczby kopii wszystkich chromosomów jednocześnie
Wykrywanie częściowej aneuploidii chromosomów
(delecje, duplikacje, amplifikacje)
Wysoka rozdzielczość (wykrywanie małych zmian)
Brak konieczności samodzielnego przygotowywania sond FISH
specyficznych dla danej aberracji (w przypadku nosicielstwa
zrównoważonej aberracji przez jedno z partnerów)
Wyniki w ciągu 48 godz
Nieprawidłowości ultrasonograficzne (zwiększone NT,
obecność dwóch lub więcej markerów aneuploidii,
zmiany objętości płynu owodniowego , IUGR)
sprzężone ze zmianami strukturalnymi (wady serca,
przepuklina przeponowa, wady OUN)
Wady widoczne w USG nie sugerujące konkretnego
zespołu, presja czasowa
Obecność w kariotypie płodu wzajemnej translokacji
chromosomowej lub chromosomu markerowego
powstałych
de novo
Atrakcyjne narzędzie diagnostyczne w PGD
[ Pobierz całość w formacie PDF ]